结肠腺癌（COAD, Colon Adenocarcinoma）是全球第三高发的恶性肿瘤，TCGA 释放的 RNA-seq + 临床 + 生存三联数据集，是入门和长期研究都极具性价比的资源。这一篇我们用 288 例肿瘤 + 41 例配对正常组织（UCSC Xena 重处理 HiSeqV2 矩阵）走完最经典的 5 步公共数据挖掘：数据清洗、差异表达、生存分析、无监督分型、通路富集。下一篇接着写免疫微环境、WGCNA 网络、LASSO 预后模型、临床联动综合解读。
第一步 · 数据准备：把三张表读成一个可分析的对象
我们直接用 data.table::fread 读 UCSC Xena 的三张文件 —— 表达谱、临床矩阵、生存表 —— 然后用 TCGA barcode 第 14-15 位的样本类型码（01-09 = 肿瘤，10-19 = 正常）把样本分成 tumor / normal 两组，再以 sampleID 把临床和生存信息 left-join 到肿瘤样本上，最后存成 .rds 供下游所有脚本复用。
Figure 1 · 队列样本组成。288 例肿瘤 (-01) + 41 例配对正常组织 (-11)。
第二步 · 差异表达：limma 一次拿到 4,631 个 DEG
表达数据已是 log2(RSEM+1)，可直接用 limma 的 lmFit + eBayes 走线性模型；阈值取 |log2FC|>1 且 FDR<0.05。最终拿到 1,564 个上调 + 3,067 个下调，共 4,631 个显著基因，差异规模与文献报道的 TCGA-COAD 数量级吻合。
Figure 2 · 火山图。粉色为上调、蓝色为下调；右上角标出了 logFC 与显著性综合最强的 20 个基因。CDH3、KRT80、ETV4、ESM1 等癌基因显著高表达。
Figure 3 · 前 50 个 DEG 的 z-score 热图。肿瘤 / 正常两块完美分块，DEG 的判别力极强。
第三步 · 生存分析：Stage 显著、年龄边缘、基因强信号
Kaplan-Meier 用 survminer 的 ggsurvplot，配合 log-rank 检验；同时把每个临床变量塞进单变量 Cox，得到一张可读的森林图。
3.1 KM by Stage —— 教科书级的分期分层
Figure 4 · OS by pathologic stage (I-IV)。log-rank p ≈ 4×10⁻⁷，I、II 期长期生存 > 80%，IV 期中位生存 < 30 个月。
3.2 临床变量单变量 Cox 森林图
Figure 5 · Univariate Cox forest。Stage 显著（p=8e-7），Age 边缘，Gender 和（被强烈下采样的）CIMP 不显著。
3.3 单基因 KM —— 强预后基因一眼可见
Figure 6 · 由全基因 Cox 排序后的 Top 4 显著基因，按 median 表达分组。蓝 = Low，粉 = High。
第四步 · 无监督分型：PCA / t-SNE / UMAP 与一致性聚类
在 288 例肿瘤上取 top-2000 MAD 基因，先用 PCA / t-SNE / UMAP 看肉眼结构，再用 ConsensusClusterPlus 跑 k=2~6 的稳定性扫描。综合 CDF / delta-area / heatmap，最终选 k=3 作为分子亚型。
4.1 PCA 染色 Stage —— 早晚期沿 PC1 渐变
Figure 7 · PCA on top-2000 MAD genes, 染色为分期。PC1 与 Stage 弱相关，暗示一部分表达变异确实由疾病进展驱动。
4.2 t-SNE / UMAP 非线性视图
Figure 8 · t-SNE。比 PCA 更聚团，但 Stage 依然没有强分组结构 —— 这暗示表达层面的主要变异并不完全等同于分期。
4.3 一致性聚类 k=3 给出 3 个稳定亚型
Figure 9 · PCA 上颜色重映射成 k=3 的 consensus cluster。三团在 PC1-PC2 平面上结构分离，C1 (n=97) / C2 (n=72) / C3 (n=119)。
Figure 10 · Top-80 MAD genes 热图，列按 cluster 切分，注释了 stage / MSI。三个 cluster 在表达模式上呈现明显差异。
第五步 · 功能富集：GO + KEGG + GSEA Hallmark 三联
基因 SYMBOL 经 org.Hs.eg.db 映射到 ENTREZ 后，分别对上 / 下调 DEG 做 GO-BP / KEGG 富集，再把 logFC 排序后跑 MSigDB Hallmark GSEA。三条线相互印证，避免把单一显著结果当成全部。
5.1 GO-BP 上调通路：细胞周期 / 染色体分离的强信号
Figure 11 · 肿瘤上调 GO-BP top 15。nuclear division、chromosome segregation、cell cycle 几乎独占榜单 —— 与肿瘤增殖表型完全一致。
5.2 KEGG 上调通路：Cell cycle / Wnt / IL-17
Figure 12 · KEGG 上调。Cell cycle、Wnt signalling、Cytokine-cytokine receptor interaction、IL-17、DNA replication 排前列。
5.3 GSEA Hallmark 全谱视角
Figure 13 · MSigDB Hallmark GSEA top 20。右侧（粉）为肿瘤上调，左侧（蓝）为下调。E2F_TARGETS NES=3.20 (p.adj=9×10⁻³⁷)，强到几乎离群。
上篇小结 · 下篇预告
把第 1-5 步串起来看：TCGA-COAD 在表达层面呈现出一个非常清晰的画面 —— 癌vs 正常之间存在数千个差异基因，并且高度聚焦在细胞周期 / Wnt / IL-17 三条轴；分子分型给出三个稳定亚型；Stage 在生存上贡献了主要的可解释方差。这套结果已经具备投稿一篇『TCGA-COAD 转录组特征解析』短文的全部素材。
下一篇会继续把分析推到 免疫微环境（ESTIMATE + ssGSEA 28-cell）、WGCNA 共表达网络与 hub 基因、LASSO-Cox 10-基因预后模型 + Nomogram + 时间 ROC、以及 临床×分子综合 landscape。预告：风险评分的 Cox HR = 19.3, p < 1e-9 ——非常强。
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