上一篇我们把数据带到了通路层面：CRC vs 正常的差异基因高度聚焦在细胞周期 / Wnt / IL-17 轴，分子分型给出三个稳定亚型，Stage 是预后的主要解释因子。这一篇会把分析推到四个更高阶的方向：（1）免疫微环境量化（ESTIMATE + ssGSEA）；（2）WGCNA 共表达网络；（3）LASSO-Cox 多基因预后模型 + 列线图；（4）临床×分子综合 landscape。
第六步 · 免疫微环境：ESTIMATE + ssGSEA 28-cell 双视角
先用 ESTIMATE 量化每例肿瘤的 stromal / immune / tumor purity 总分，再用 ssGSEA 在 28 套免疫细胞 / 通路签名上给每例样本打分，最后把所有信号按第四步的 consensus cluster 切开看。
6.1 ESTIMATE 三大评分在三个 cluster 间高度差异
Figure 14 · ESTIMATE 四联图（Stromal / Immune / ESTIMATE / Tumor purity）按 consensus cluster 分箱，两两 Wilcoxon。三个 cluster 之间在免疫景观上呈现统计学高度显著的分层。
6.2 ssGSEA 28-cell 免疫景观全图
Figure 15 · 288 例样本 × 28 个免疫签名 z-score 热图。顶部条带：cluster / MSI / stage / 免疫总分。右侧的 chemokine / cytotoxicity / IFN response / antigen presentation 在 C3 中系统性升高。
6.3 免疫检查点基因表达 —— 直接关系到能不能用 PD-1 / CTLA-4
Figure 16 · 6 个核心免疫检查点（PDCD1 / CD274 / CTLA4 / LAG3 / HAVCR2 / TIGIT）的表达在三个 cluster 间的对比。C3 高表达组明显占优。
第七步 · WGCNA：共表达网络 + Hub 基因
在 top-5000 MAD 基因上做 signed WGCNA。先扫软阈值保证无标度拓扑，再 blockwiseModules 切模块，最后把模块的 eigengene 与 8 个临床 / 分子性状做相关。
7.1 软阈值扫描
Figure 17 · 左：scale-free R² 随软阈值的变化（虚线为 0.85 阈值）；右：mean connectivity 随软阈值衰减。算法自动选择了使 R² ≥ 0.85 的最小幂作为最终软阈值。
7.2 模块 × 性状相关热图 —— 看哪些模块和分期 / 生存绑定
Figure 18 · 模块 - 性状相关。turquoise 模块（2,078 个基因）与 stage、OS 时间均强相关，是 COAD 的『stage / 预后驱动模块』。
Figure 19 · 各模块与 stage 和 OS 的相关性条形图，方便快速排序。
第八步 · LASSO-Cox 预后模型：10 基因签名 + 列线图
候选基因池：第二步的 4,631 个 DEG → 单变量 Cox p<0.01 筛到 124 个 → 70/30 切训练-测试 → LASSO-Cox 10-fold CV。当 lambda.min 过严时自动回退到路径上保证 ≥ 8 个非零系数的 lambda，最终得到 10 基因签名：CPT2 · RP9P · SULT1B1 · TIGD1 · PPARGC1A · ITLN1 · FZD3 · C5orf46 · APC2 · WNT16。其中 APC2、WNT16、FZD3 是 Wnt/β-catenin 通路成员，PPARGC1A / CPT2 是代谢调控因子，与肿瘤代谢重编程对应。
8.1 LASSO 交叉验证与系数路径
Figure 20 · 10-fold CV partial likelihood deviance 随 log(λ) 变化；左侧虚线为 λ_min，右侧为 λ_1se。
Figure 21 · LASSO 系数路径。随着 λ 增大基因被依次剔除，最终保留 10 个非零特征。
8.2 风险评分 KM：训练 / 测试 / 全集三联
Figure 22 · 训练集 KM。High vs Low risk 高度显著分离。
Figure 23 · 测试集 KM。模型在未见过的样本上保持显著分离 —— 表明并非过拟合。
Figure 24 · 全集 KM。log-rank p = 8×10⁻⁶，连续型 Cox HR = 19.3, p = 7×10⁻¹⁰，是一个非常强的风险评分。
8.3 时间依赖 ROC：1 年 / 3 年 / 5 年
Figure 25 · time-dependent ROC，左 = 全集，右 = 测试集。1y / 3y / 5y AUC 均显著高于 0.5 对角线。
8.4 风险评分曲线 + 状态散点 + 签名热图
Figure 26 · 上：样本按风险评分排序后的 risk score 曲线；下：每例样本的 OS 时间与生存状态散点。可看到高风险端死亡密度显著升高。
Figure 27 · 10-基因签名 z-score 热图，列序与风险评分同步。
8.5 多变量 Cox 森林 + 列线图 + 校准
Figure 28 · 多变量 Cox 森林：age (p=0.018)、stage (p=4×10⁻⁵)、risk (p=7×10⁻⁵) 三项独立显著。
Figure 29 · 列线图。把 age / gender / stage / risk 转换成总分，可读出 1 / 3 / 5 年 OS 概率。可直接用于临床场景演示。
Figure 30 · 3 年 OS 校准曲线（bootstrap=300）。实际 vs 预测沿对角线分布，模型校准度良好。